2013年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了三位科學(xué)家，表彰其在細(xì)胞間囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制領(lǐng)域作出突出貢獻(xiàn)。諾獎(jiǎng)的肯定，使得細(xì)胞分泌的胞外囊泡及其生理學(xué)功能成為熱點(diǎn)，得到廣泛的研究。
1外泌體是一種胞外囊泡
不同類型的細(xì)胞均可以通過(guò)出芽方式釋放各種各樣的膜包裹的囊泡（如外泌體、微囊泡、凋亡小體）到它們的細(xì)胞外環(huán)境中，大小從大約40 nm到幾mm不等。這些分泌的囊泡統(tǒng)稱為胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV），或稱為微囊泡（microvesicles）[1]。EV的外膜為磷脂膜，包含特定細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)組合，包括酶、生長(zhǎng)因子、受體和細(xì)胞因子以及脂質(zhì)、編碼和非編碼RNA和代謝物[1, 2]。直徑約為40-150nm的胞外囊泡，即為外泌體（exosome）。
早在20世紀(jì)60年代，EV的生理功能得到闡述，EV在細(xì)胞、器官之間，甚至在有機(jī)體之間傳遞信息，并在體液中檢測(cè)到，如血液、尿液、腦脊液、母乳和唾液[3]。由于其穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)和在生物液中的運(yùn)輸能力，EV可以在細(xì)胞之間運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移生物活性分子，如蛋白質(zhì)和RNA，介導(dǎo)靶向細(xì)胞間信號(hào)傳遞，甚至是遺傳信息的功能性轉(zhuǎn)移，這一發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了該領(lǐng)域的發(fā)展[2, 4, 5]。
2MSC分泌的EV及其功能應(yīng)用
同樣，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）也分泌大量的EV，EV內(nèi)容物包括各種蛋白和RNA等。在MSC來(lái)源的EV中，大多數(shù)RNA（<80%）；另外還有一些小RNA，其中miRNA約為44%、tRNA約為47%[6]。干細(xì)胞通過(guò)這些胞外囊泡（EV）與其他組織細(xì)胞相互交流信息，發(fā)揮干細(xì)胞的治療作用。
MSC來(lái)源的EV也表達(dá)MSC表型標(biāo)記，如CD29、CD73、CD44和CD105，可以通過(guò)傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定[7]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示人MSC-EV許多獨(dú)特的蛋白質(zhì)，如表面受體（PDGFRB、EGFR和PLAUR）、信號(hào)分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13/GNG12、CDC42和VAV2）、細(xì)胞粘附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素和LGALS1/LGALS3），以及MSC相關(guān)抗原（CD9、CD63、CD81、CD109、CD151、CD248和CD276）[8]。
MicroRNAs（miRNAs）是一種短的、非編碼的RNA，它調(diào)節(jié)mRNA靶標(biāo)的表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄后沉默中發(fā)揮作用。miRNAs在干細(xì)胞中的重要作用已經(jīng)在廣泛的生物學(xué)過(guò)程中得到了研究，包括發(fā)育、分化、細(xì)胞死亡、干細(xì)胞增殖和分化、免疫反應(yīng)、衰老和癌癥。據(jù)估計(jì)，人類基因組編碼超過(guò)1000個(gè)miRNAs，針對(duì)大約60%的人類蛋白編碼基因[9]。通過(guò)質(zhì)譜和陣列分析，已經(jīng)在MSC-EVS中鑒定出850多個(gè)獨(dú)特的基因產(chǎn)物和160多個(gè)miRNAs[10, 11]。
（一）組織器官損傷
MSC-EV已經(jīng)在幾種不同類型的疾病中顯示出令人鼓舞的治療效果，包括腎損傷、心臟損傷、腦損傷和肝肺損傷等[12, 13]。MSC的旁分泌/內(nèi)分泌機(jī)制很可能是由MSC-EV介導(dǎo)的[14, 15]。MSC-EV恢復(fù)和維持組織微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)的潛力取決于蛋白質(zhì)和RNA轉(zhuǎn)移的生化能力。
MSC分泌的EV在急性和慢性腎損傷中均有保護(hù)的特性[16-18]。MSC-EV中的生長(zhǎng)因子mRNA可以轉(zhuǎn)移到順鉑損傷的近端腎小管上皮細(xì)胞(PTEC)，可促進(jìn)PTEC增殖；IGF-1R的mRNA通過(guò)體外水平轉(zhuǎn)移到腎小管上皮細(xì)胞，增強(qiáng)了腎小管細(xì)胞對(duì)局部產(chǎn)生的IGF-1的敏感性[19]。如果骨髓MSC-EV的microRNA耗竭，那么MSC-EV在急性腎損傷中的固有再生修復(fù)能力出現(xiàn)顯著的降低，提示在急性腎損傷后的恢復(fù)過(guò)程中，miRNAs起著關(guān)鍵作用[20]。
在心肌梗死方面，體外擴(kuò)增的MSC培養(yǎng)上清液已成功用于縮小小鼠心肌梗死范圍[15, 21-23]。MSC上清液的促再生活性被證明為EV組分，而去除EV后的可溶性組分并沒(méi)有作用效果[15]。MSC-EV介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用可減輕大腸桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷和低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓[24, 25]。MSC-EV還展示了減輕藥物誘導(dǎo)肝損傷和肝纖維化的能力[26, 27]。
MSC-EV對(duì)血管生成有直接的積極促進(jìn)作用[28, 29]。在大鼠模型中，MSC-EV顯著改善了后肢缺血的灌注，加速了皮膚燒傷后的再上皮化，并提高了同種異體皮膚移植物的存活率[30, 31]。MSC-EV給藥已被證明在中風(fēng)模型缺血性閉塞后促進(jìn)功能恢復(fù)和新生血管，顯著改善了卒中誘導(dǎo)后的功能結(jié)果，但是MSC組和MSC-EV組沒(méi)有明顯的療效差異[32, 33]。在綿羊模型中，全身應(yīng)用MSC-EV后也觀察到大腦缺氧損傷的改善[34]。miRNA-133b似乎與MSC-EV介導(dǎo)的大鼠缺血性卒中后的功能恢復(fù)有關(guān)[35]，而miRNA-22似乎與MSC-EV介導(dǎo)的缺血性心臟病心肌細(xì)胞的抗凋亡作用有關(guān)[36]。因此，MSC-EV可用于中風(fēng)的治療，作為干細(xì)胞輸注的替代方法，可改善神經(jīng)預(yù)后，增加血管生成和神經(jīng)生成[37, 38]。
另外，研究表明，來(lái)自健康供者的骨髓MSC-EV含高水平的腫瘤抑制因子miRNA-15a，miRNA-15a能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，從而維持疾病的穩(wěn)定狀態(tài)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；而來(lái)自多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓MSC-EV含低水平的腫瘤抑制因子miRNA-15a[39]。健康和多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓MSC-EV激活A(yù)KT通路促進(jìn)了骨髓瘤細(xì)胞的存活和抗藥性[40]。也有研究證明健康供者骨髓MSC-EV通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，降低了骨髓瘤細(xì)胞的活性、增殖和遷移[41]。
（二）免疫調(diào)節(jié)功能
MSC來(lái)源的外泌體和EV具有相似的免疫調(diào)節(jié)功能，MSC-EV對(duì)許多類型的免疫細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括樹突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞）、T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[6, 42-44]。然而，有意思的是，在炎性關(guān)節(jié)炎模型中，MSC來(lái)源的外泌體在體內(nèi)抑制炎癥比MSC更加有效[45]。
MSC-EV對(duì)DC細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制部分是由microRNAs（miR-21-5p、miR-142-3p、miR-223-3p和miR-126-3p）介導(dǎo)的[46]。MSC-EV還可以通過(guò)增強(qiáng)M2巨噬細(xì)胞極化和間接驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)揮免疫抑制作用[47]。MSC-EV還被證明可以抑制健康供者和GvHD患者的NK細(xì)胞和其他外周白細(xì)胞的激活[48]。MSC-EVS在體外與PBMC共培養(yǎng)時(shí)抑制T細(xì)胞的激活，促進(jìn) Treg 細(xì)胞的增殖[48, 49]。
根據(jù)陣列分析，與GVHD改善相關(guān)的多種可溶性因子在MSC-EV中呈現(xiàn)高度表達(dá)[50]。靜脈輸注MSC-EV可抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，從而延長(zhǎng)急性移植物抗宿主?。℅VHD）小鼠的存活時(shí)間，并減少多個(gè)器官的病理?yè)p傷[51-53]。
3MSC-EV在體內(nèi)分布和安全性
在小鼠體內(nèi)的生物發(fā)光和熒光介導(dǎo)的斷層成像顯示，靜脈注射EV的主要部位是脾、肝、肺和腎，也可以在注射后30分鐘內(nèi)在腦、心臟和肌肉中檢測(cè)到EV，在60分鐘后尿液中檢測(cè)到EV[54]。
雖然已經(jīng)觀察到，在動(dòng)物腫瘤模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，MSC-EV的促腫瘤和抗腫瘤作用的報(bào)道[55, 56]，但到目前為止還沒(méi)有其他副作用的報(bào)道。動(dòng)物模型中沒(méi)有檢測(cè)到MSC-EV給藥的任何副作用，即使用PEG方法制備的MSC-EV在動(dòng)物身上的劑量比相應(yīng)的急性GvHD患者高100倍。因此，可以認(rèn)為MSC-EV給藥基本上是安全的[57]。由于EV不能自我復(fù)制，因此缺乏任何內(nèi)源性腫瘤形成潛力[58]。
4MSC-EV的臨床應(yīng)用
2011年進(jìn)行了第一次有記錄的臨床MSC-EV給藥；MSC-EV以遞增的劑量應(yīng)用于1例類固醇耐藥的GVHD患者，從4×107個(gè)MSC培養(yǎng)上清液中分離的MSC-EVS數(shù)量為1.3-3.5×1010個(gè)顆粒或0.5-1.6mg；這個(gè)劑量的MSC-EV被定義為1個(gè)單位，MSC-EV每隔2~3天靜脈注射一次，共2周，患者總共接受了4個(gè)單位，GvHD癥狀顯著下降，每日類固醇劑量可從125 mg減少到30 mg，患者在MSC-EV治療后穩(wěn)定了5個(gè)月，而且MSC-EV給藥耐受性良好，未觀察到副作用[48]。
對(duì)20例慢性腎臟?。–KD）患者進(jìn)行的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究表明，臍帶MSC-EV（2次，相隔1周）可改善腎小球?yàn)V過(guò)率、血肌酐水平、血尿素和尿白蛋白肌酐比值，伴隨著TGF-β1、IL-10水平明顯升高和血漿TNF-α水平顯著下降（在治療后12周的TGF-β和IL-10水平高于一年后；相反，腫瘤壞死因子-α水平在一年后略低于12周后），沒(méi)有一名患者顯示出任何副作用[59]。
MSC-EV應(yīng)用于8例患者用于牙槽骨再生，沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)；放射學(xué)評(píng)估顯示所有病例均有早期骨形成；注射部位的炎性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)很少[60]。這個(gè)臨床研究證明了MSC-EV在骨再生醫(yī)學(xué)中具有較大的成骨潛力。
對(duì)7例長(zhǎng)期存在的大型特發(fā)性難治性黃斑裂孔（MH）患者，年齡51~75歲，行玻璃體切除、內(nèi)界膜剝離、MSC（2例）或MSC-EV（外泌體）（5例）玻璃體腔內(nèi)注射；5例MH閉合術(shù)患者最佳矯正視力提高，其中1例接受MSC治療的患者在視網(wǎng)膜表面觀察到纖維膜，1例接受較大劑量MSC-EV的患者出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[61]。
5MSC-EV的產(chǎn)業(yè)化
MSC-EV具有免疫調(diào)節(jié)活性并促進(jìn)再生過(guò)程，其方式顯然與MSC相當(dāng)。因此，基于EV的無(wú)細(xì)胞療法，為多種疾病提供了一種基于干細(xì)胞治療的有前途的替代方案[12]。與細(xì)胞療法相比，EV療法具有一些優(yōu)勢(shì)，但由于該領(lǐng)域的新穎性，其臨床分級(jí)生產(chǎn)、質(zhì)量保證和應(yīng)用缺乏國(guó)際公認(rèn)的指南。
改變MSC的培養(yǎng)環(huán)境，用不同的外界刺激預(yù)處理，這不僅可以增加EV的產(chǎn)量，還可以調(diào)節(jié)它們的成分，從而增強(qiáng)有益的治療效果[62]。例如，無(wú)論是用中風(fēng)患者血清培養(yǎng)MSC，還是用缺血腦組織提取液處理，都可以激活MSC釋放更多的EV [63, 64]。MSC培養(yǎng)時(shí)給予炎癥刺激，將增強(qiáng)抗炎特性的EV釋放[65]。應(yīng)當(dāng)評(píng)估EV制備的純度和一致性，在EV收獲過(guò)程中使用的所有生物材料都符合要求的法規(guī)遵從性。
與傳統(tǒng)的2D平面培養(yǎng)的MSC相比，與微載體結(jié)合的3D球形培養(yǎng)的MSC顯示出更高的EV分泌量，并降低了整合素的表達(dá)，原因可能在于3D培養(yǎng)的MSC細(xì)胞密度高于2D培養(yǎng)[66-68]。采用3D的培養(yǎng)方法方法在MSC-EV的生產(chǎn)中可能有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)?1)需要大量的培養(yǎng)基才能獲得大量臨床使用的EV；(2)通過(guò)持續(xù)的培養(yǎng)基灌流，避免代謝副產(chǎn)物在生物反應(yīng)器中積累，可以維持MSC的活性，而無(wú)需使用含有大量異種EV的血清；以及(3)通過(guò)控制進(jìn)出生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基流量來(lái)連續(xù)產(chǎn)出[37]。
超速離心是收集EV最常用、最常規(guī)的方法。商業(yè)上可以買到的試劑盒，是一種快速而簡(jiǎn)單的試劑盒，但它是一種相對(duì)粗糙的分離方法，受到許多可溶性蛋白污染。超速離心的方法足以獲得純EV用于實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，但在臨床環(huán)境下，這種方法耗時(shí)長(zhǎng)，不適合大規(guī)模生產(chǎn)EV。
超速離心促進(jìn)囊泡聚集，常常共分離到可溶性因子和蛋白質(zhì)[69]?；诿芏忍荻鹊姆蛛x允許基于浮力密度分離囊泡，為EV凈化提供了最高效率[70, 71]。最近，一些新興的技術(shù)，如尺寸排除色譜、聲學(xué)分離、納米捕捉器、流場(chǎng)流動(dòng)分級(jí)，都有可能從不同的樣品基質(zhì)中分離出EV，每種方法都利用了EVS的特定生物物理特性，如它們的大小、密度、形狀或表面受體[72]。
以EV為基礎(chǔ)的治療藥物生產(chǎn)的另一個(gè)方面是質(zhì)量保證。雖然來(lái)自幾個(gè)動(dòng)物模型和已報(bào)道的人體研究的數(shù)據(jù)表明，MSC-EV發(fā)揮了治療作用，沒(méi)有引起副作用，但必須建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以確保所產(chǎn)生的EV產(chǎn)品的質(zhì)量、安全性和有效性。EV儲(chǔ)存在等滲緩沖液中，以防止儲(chǔ)存和凍融循環(huán)期間的pH變化。比如人中性粒細(xì)胞來(lái)源的抗菌胞外囊泡（EV）在-80°C下保存對(duì)EV數(shù)量和大小沒(méi)有顯著影響（最好不超過(guò)7天），而廣泛使用的冷凍保護(hù)劑能誘導(dǎo)EV裂解[73]。
因此，為了開發(fā)基于EV的藥物，至少需要克服一些限制：(1)為EV的大規(guī)模制備、純化和儲(chǔ)存建立推薦的分離方案；(2)EV的量化、分子和物理EV表征的標(biāo)準(zhǔn)化方案；以及(3)明確的臨床使用質(zhì)量控制(QC)標(biāo)準(zhǔn)[58]。
干細(xì)胞外泌體（這里特指MSC-EV）是一個(gè)研究和應(yīng)用都值得期待的好方向，但是需要腳踏實(shí)地地去做些工作。